胚発生を阻害する何らかの毒性がガラス器具に潜在？

近畿大学は4月2日、生殖補助医療や畜産、基礎研究分野で受精卵の操作や培養に用いられるガラス器具から受精卵（胚）の発生を妨げる毒物が漏出することを見出し、その毒物が亜鉛であることを同定し、マウス、ウシ、ヒトの受精卵に対する影響を詳細に解析することで、対処法を開発したと発表した。この研究は、同大生物理工学部遺伝子工学科の山縣一夫教授、扶桑薬品工業株式会社の八尾竜馬上席研究員、奈良県立医科大学医学部の栗本一基教授、慶應義塾大学理工学部の舟橋啓教授、浅田レディースクリニックの野老美紀子研究員、東京農工大学大学院グローバルイノベーション研究院の杉村智史教授、京都大学の山本拓也教授らの研究グループによるもの。研究成果は、「Biology of Reproduction」に掲載されている。

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日本人の生殖補助医療や畜産、基礎研究分野では、卵子や精子を体外に取り出し、培養液の中で受精、発生させた後に母体に戻す体外受精が行われている。最初の体外受精児が生まれた1978年から50年近く、受精方法や培養液など、受精卵の発生率や妊娠率を向上させるためのさまざまな技術開発がされてきた。その結果、生殖補助医療現場では、1980年当時は5％ほどだった出生率が、現在では30％ほどに上昇している。出生率をさらに向上させるためには、胚の培養環境の改善が必要と考えられている。

体外受精の操作には、多くのガラス器具を用いる。例えば、胚を培養する際の培養皿には、胚を高精細に観察できるように底面が薄いガラスになっているもの（ガラスボトムディッシュ）を使用する。また、培養液中の不純物や菌を除くためのガラス繊維を含むフィルターや、胚を操作するための細いガラス管なども用いられている。これら以外にも、顕微授精で用いる針や一部の培養液のボトルなどもガラス製だ。

研究グループは以前の研究において、胚の発生過程を連続的に長時間観察するライブセルイメージング技術を開発した。この技術を用いることで、大量の画像データに基づき、胚発生における微妙な違いを数値として検出することが可能になった。その実験の過程で、多くの実験条件をそろえているにも関わらず、まれに胚発生率が低下することがあることに気づき、検討の結果、培養に使用しているガラスボトムディッシュが原因であることを突き止めた。この経験から、普段何気なく使用しているさまざまな実験器具、特にガラス器具には胚発生を阻害する何らかの毒性が潜在するという仮説を立て、研究を開始した。

亜鉛を原因物質と特定、5～80μMの濃度で培養液に漏出

はじめに、培養液に触れるさまざまなガラス器具（ガラスボトムディッシュ、培養液の滅菌フィルター、胚の移動に用いるガラスキャピラリー）を用いてマウス胚発生への影響を検討した。その結果、程度の差はあるものの、いずれの器具、いずれのメーカーのものにも毒性が認められた。

そこで、ガラスに由来する毒性の実体を成分分析によって探索したところ、ガラスから漏出する「亜鉛」が原因物質であることを突き止めた。胚発生を阻害するガラス器具からは、亜鉛が5～80μMの濃度で培養液に漏出していた。亜鉛がマウス胚の発生に与える影響を明らかにするため、培養液に亜鉛を添加して胚培養試験を行った。その結果、亜鉛添加区では濃度依存的に胚盤胞期までの発生が大きく阻害されることがわかった。

亜鉛に暴露したマウス胚で遺伝子発現のかく乱を確認

次に、ライブセルイメージングで核や細胞分裂の動態を観察したところ、亜鉛はマウス胚の染色体分配や細胞質分裂に影響を与え、発生速度の遅延の原因になることがわかった。また、RNAシークエンスによる遺伝子発現解析を行ったところ、亜鉛はマウス胚の遺伝子発現をかく乱することがわかった。

さらに、亜鉛に暴露されたマウス胚の産仔までの影響を検討するため、胚盤胞期まで発生した胚を仮親の子宮に移植した。その結果、産仔は通常通りの割合で生まれる一方、産仔の体重が亜鉛に暴露していない胚と比較して平均で18％増加することがわかった。

EDTAの適正添加、ガラス器具の十分な洗浄により胚の発生率低下を抑制可能

続いて、亜鉛の毒性を抑制する方法を検討した。亜鉛のような金属イオンはキレート剤であるEDTA（エチレンジアミン四酢酸）と結合すると、作用が抑制されることが知られている。そこで、亜鉛存在下の培養液に通常より高濃度のEDTAを添加し、マウス胚の培養試験を行った。その結果、EDTAは胚盤胞期までの発生率を大幅に改善するものの、EDTAと亜鉛の存在下で培養した胚を仮親に移植すると出生率が低下することがわかった。そこで、EDTAによる処理時間を検討し、受精直後から8細胞期までに限定すると、仮親に移植後の出生率の低下が回避できることがわかった。また、使用前にガラス器具を十分洗浄することによっても胚の発生率低下を抑制することができた。

亜鉛暴露ヒト胚において異常な細胞質分裂を示す胚が増加

最後に、マウス胚、ウシ胚、ヒト胚で亜鉛の毒性を比較検討した。その結果、ウシ胚はマウス胚よりも高い亜鉛濃度でも発生し得ることがわかった。ヒト胚は倫理的・技術的観点から、多数の胚を用いて詳細な検討を行うことは困難であるため、ライブセルイメージングを用いて限られた胚数からも多くの情報を得ることを試みた。その結果、亜鉛は、染色体分配などには影響は与えないものの、異常な細胞質分裂を示す胚が増加した。

「研究から、これまでの体外受精における意図しない成績低下の要因の一つとして、ガラス器具から漏出する亜鉛が関与している可能性が考えられた。体外受精を行う際は、ガラス器具から漏出する亜鉛を考慮することで、成績の向上や安定化が期待される」と、研究グループは述べている。（QLifePro編集部）