巨大遺伝子を導入のブタ作出は大きな課題だった

明治大学は7月28日、体細胞クローニング技術と人工染色体技術を組み合わせることにより、世界で初めてヒト人工染色体を導入したブタの作出に成功したと発表した。この研究は、同大バイオリソース研究国際インスティテュートの渡邊將人研究員、同大農学部生命科学科の長嶋比呂志教授（兼 同大バイオリソース研究国際インスティテュート所長）、鳥取大学医学部生命科学科の香月康宏教授らの研究グループによるもの。研究成果は、「Molecular Therapy-Nucleic Acids」に掲載されている。

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ブタはヒトとの解剖学的・生理学的類似性から、実験動物として多くの医学研究に利用されている。大型実験動物としてのブタの価値は、ブタを用いた研究から得られる知見のヒトへの外挿性の高さにある。実際、ヒトの疾患を模倣した病態モデル動物の作出において、マウスでは再現できないヒトの病態を、ブタではかなり忠実に再現できることが示されている。CRISPR-Cas9などゲノム編集技術の登場により、ブタにおいても遺伝子改変が効率的に可能となり、病態モデルブタを含め多くの遺伝子改変ブタが作出されている。しかし、非常に巨大な遺伝子を導入した遺伝子改変ブタの作出は、いまだチャレンジングな課題となっていた。

ヒトジストロフィン遺伝子全長搭載のヒト人工染色体をDMD発症ブタに導入

ヒトおよびマウス人工染色体は、任意の巨大遺伝子や複数の遺伝子を導入できる画期的な運び屋（ベクター）だ。これを利用した染色体導入技術により、任意の哺乳類細胞から任意の哺乳類細胞へ人工染色体を運ぶことが可能。体細胞クローニング技術では細胞からダイレクトに個体（クローン）を生産することができる。

今回の研究では、体細胞クローニング技術と人工染色体技術を組み合わせ、非常に巨大なヒトジストロフィン遺伝子全長が搭載されたヒト人工染色体（DYS-HAC）を、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）を発症するブタの細胞へ導入し、DYS-HACが導入された遺伝子改変ブタの作出に取り組み、同時にヒト人工染色体によるDMDの病態に対する治療効果も検討した。

DYS-HAC導入DMDブタは1か月齢時に全頭生存、血中クレアチンキナーゼ値改善

研究グループは、微小核細胞融合（Microcell-mediated chromosome transfer：MMCT）法により、ヒトジストロフィン遺伝子全長を含むヒト人工染色体（DYS-HAC）を、筋ジストロフィーを発症するブタ（DMDブタ）由来の線維芽細胞へ導入した。このDYS-HAC導入細胞を体細胞クローニングの核ドナーとして利用し、DYS-HACが導入されたブタの作出を試みた。

構築したクローン胚を借り腹（レシピエント）ブタへ外科的に移植し、4頭のDYS-HACクローンブタ産仔を得ることに成功した。DYS-HACベクターには蛍光マーカーとして緑色蛍光タンパク（GFP）が合わせて搭載されており、得られた4頭のDYS-HACブタ全頭でGFPの蛍光が観察され、全身にDYS-HACベクターが導入されていることが確認された。

通常、DMDを発症するブタは、生後1か月以内に多く（約75％）が死亡する。同研究で作出したDYS-HACを導入したDMDブタは1か月齢時で全頭が生存し、後肢運動機能の回復、筋ジストロフィーの病態マーカーの一つである血中クレアチンキナーゼ値の有意な改善も認められたという。また、DYS-HACブタの筋肉における組織学的解析では、導入したDYS-HACベクター由来のヒトジストロフィンが産生されていることが明らかになった。

遺伝性疾患の治療に対する人工染色体の有効性示唆

一方で、DYS-HACはマウスでは安定的に細胞内（核内）で保持されることが示されているが、ブタにおいては経時的に脱落することが観察され、使用する動物種に適した新規人工染色体開発の必要性も明らかになった。同研究では、人工染色体が導入されたブタの作出に世界で初めて成功し、遺伝性疾患の治療に対する人工染色体の有効性が示唆された。

再生医療や異種移植、畜産・農学分野などへの貢献にも期待

今回の研究により、体細胞核移植技術と人工染色体技術で作られる「Transchromosomic cloned pigs（Tc pig）」が、新たな遺伝子改変ブタの一つとして加わり、今後は再生医療や異種移植など多くの医学研究にも貢献することが期待される。

「本研究により、メガベース単位の巨大遺伝子を導入したブタの作出が可能となったことは、医学・医療研究分野のみならず、畜産・農学分野の発展にも貢献することが期待される」と、研究グループは述べている。（QLifePro編集部）